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权威发布:葡萄霜霉菌的抗药性检测与科学用药

2019-11-24 19:50:14

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一、葡萄霜霉病的有害症状

葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌[·伯克和柯蒂斯·贝尔引起的世界性病害。et Detoni]。目前,世界上几乎所有葡萄产区都发生葡萄霜霉病。葡萄霜霉病主要危害叶片,也可感染嫩绿组织,如新芽、卷须、叶柄和幼果。在叶片感染初期,前表面形成浅黄色水浸小斑点,边缘不清,然后逐渐扩展成褐色不规则或多边形病斑,几个斑点连在一起形成不规则的大斑点。天气潮湿时,病斑背面即病原体的孢子囊和孢子囊产生白霜霉菌。当疾病严重时,患病的叶子会提早枯萎和脱落。嫩芽感染后,初期出现不同颜色的淡黄色水斑,然后变成褐色稍凹陷的病斑,湿时病斑也出现白霜霉菌。当病情严重时,新芽会扭曲、停止生长,甚至死亡。卷须、轴和叶柄有时会受伤,症状与嫩芽相似。幼果受损,患病部位褪色、变硬、消退,果实上生长白色霜霉病,容易萎缩脱落。随着果粒变大,病原体的感染几率降低,感染后病原体发展缓慢,可导致果粒表面呈凹形,逐渐变紫、僵硬、皱缩,容易脱落(图1)。

灰葡萄孢的损害症状

二.灰葡萄孢的耐药性

病原菌耐药性是指个体或群体目标生物在与某种药物持续接触一定时间后,降低了其对药物的遗传敏感性,从而降低药物效应或失去控制效应的现象。葡萄霜霉病是一种空气传播的流行病,化学防治是病害防治的重要方法之一。葡萄生产中常用的系统杀菌剂主要包括甲氧基丙烯酸酯(嘧菌酯)、羧酸酰胺(烯酰吗啉)、苯基酰胺(甲霜灵)、氰乙酰胺(霜脲氰)和磺胺咪唑(氰霜唑)。由于化学药剂科学应用技术的不完善、使用者相关知识的缺乏以及该领域药物的不合理使用,许多防治番茄灰霉病菌的化学药剂产生了抗药性,防治效果迅速下降,严重威胁葡萄产业的健康发展。

三、葡萄霜霉病抗药性检测技术

中国农业科学院植物保护研究所葡萄害虫研究组采用叶盘漂浮法检测不同产地番茄灰霉病菌对不同药剂的抗性。同时还开发了taqman-mgb检测技术,不受实验材料和培养环境等外部条件的限制,具有方法稳定、检测效率高、灵敏度高、特异性强、假阳性低等优点。

1.传统的检测方法——叶片盘浮动法(图2)

(1)样品采集和处理:将野外采集的新鲜葡萄霜霉病样品在室内重新培养,形成新鲜细菌层;

(2)制作叶盘:选取健康的‘里扎马特’鲜嫩叶片,对叶片表面进行消毒,在超净工作台用直径为15 mm的打孔机将叶片冲压成叶盘,将叶盘轻轻放入相应浓度的药液中,叶背朝上,每盘10片,对照组用无菌水代替药液;

(3)接种霜霉菌:将纯培养的新鲜霜霉菌制备成浓度为1×106孢子/ml的孢子悬浮液,将孢子悬浮液滴在叶盘中心,每片叶盘滴10μl;

(4)培养及结果调查:将其置于培养箱中黑暗处理24小时,然后用灭菌滤纸条吸去叶盘背面的液滴,置于培养箱中培养,7天后进行结果调查。根据抗药性的发生率。

图2叶碟法测定耐药性示意图

2.分子生物技术检测-taqman-mgb耐药性检测技术

番茄灰霉病菌对烯酰吗啉和嘧菌酯产生抗性后,根据基因突变原理建立了Taqman-mgb检测技术。

(1)样品采集和处理:将田间采集的新鲜葡萄霜霉病样品在室内保湿培养,形成新的霉菌层;

(2)霜霉菌dna的提取:用e-z0r96真菌DNA试剂盒提取试剂盒进行提取;

(3)利用研制的taqman-mgb探针,通过荧光定量pcr检测不同葡萄产区霜霉病的耐药性。

四.测试结果

1.在一些生产区,用叶盘法检测霜霉菌对甲霜灵、氰霜唑和霜脲氰的抗性。该方法所需测试设备少,操作简单,节省材料,最类似于现场反应(图3)。

图3叶盘法的结果

2.利用taqman-mgb分子检测技术对部分葡萄产区番茄灰霉病菌对嘧菌酯和烯酰吗啉的抗性进行了鉴定。发现不同地区的抗性差异明显。灰葡萄孢种群对生活质量的抗性达到100%,山西种群对生活质量的抗性频率为4%(图4)。对于caa杀菌剂,辽宁北镇霜霉菌群体中抗性等位基因的频率达到96%,其中杂合敏感型占45%,抗性菌株占51%(图5),表明该地区抗性群体正在迅速扩散。该方法能准确区分野生型、耐药突变型和杂合型,灵敏度达到1pg。除了单菌株鉴定之外,还可以对混合样品进行定量检测,可以大大减少工作量,提高效率,适合荧光定量pcr的实验室应用。

图4 qoi耐药性的aqman-mgb探针检测

图5检测caas抗性的aqman-mgb探针

根据试验结果,嘧菌酯和烯酰吗啉不能在辽宁省北镇生产区继续用于防治霜霉病。建议替代其他杀菌剂防治霜霉病,注意连续使用次数。通常,同一杀菌剂不能连续使用3次以上。山西产区可以继续使用这两种药物来防治葡萄霜霉病,但要注意药物的交替使用。抗药性的检测不仅为霜霉病的防治奠定了基础,也为农药的精确选择、杀菌剂的合理轮换和减少农药的使用提供了科学的指导。

作者:孔繁芳、王忠岳、刘永强、章昊(中国农业科学院植物保护研究所)

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